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工程细胞构建及筛选

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高产细胞株构建平台

成都金凯生物提供一套从DNA序列到高产重组蛋白细胞株的解决方案。我们具有多年的细胞株开发经验和自主的表达系统,拥有高效克隆筛选平台和单细胞确认和记录等先进设备满足高效筛选和法规要求。具有先进的细胞培养工艺开发,并从亲和力、生物活性和关键质量属性指标等方面进行分析和评价,确保细胞株和目的产物满足新药申报需求。

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一、细胞株构建具体方案

1、高表达载体构建

   委托专业基因合成公司合成客户提供的DNA序列,将合成基因重组到自主表达载体,提供完备的实验方案、研究报告、基因合成证明、测序图谱及序列分析结果。

2、细胞株转染

   将表达载体转染至CHO-DG44中(本公司提供),或转染至客户指定细胞中,可提供瞬时转染制备小量样品;脂质体或电转细胞筛选稳定细胞株,做多次转染,以满足筛选到高产细胞株。供完备的实验方案、研究报告、宿主细胞证明和小量瞬转蛋白。

3、高表达pool筛选

细胞转染后,通过筛选获得稳定高产细胞pool,如CHO-DG44以MTX加压筛选,通过多轮压力筛选,细胞完成恢复后,评估pool的的重组蛋白的产量和质量,至少3个pool用于单克隆细胞筛选。 

4、单细胞克隆筛选

将经pool筛选后的细胞接种到半固体培养基中,通过clonepix的荧光识别,筛选接种细胞,每个pool挑取180个克隆,经表达量评估后,每个pool淘汰后剩余10-20个克隆,这些克隆不断扩大培养至摇瓶,摇瓶通过批次评价(生长曲线和表达量),最终剩余3-5株细胞。

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5、流加评估高产克隆

    将3-5株细胞送至工艺培养部以生物反应器进行评估,通过流加工艺的研究和评估,以重组蛋白产量和关键蛋白属性指标评估蛋白质量,获得最终生产细胞株,该细胞株可用于构建原始细胞库、主细胞库和工作细胞库。

6、细胞传代稳定性研究

   评估原始细胞库的蛋白表达量和蛋白质量稳定性在细胞传代至少60代次后的稳定性。原始细胞库、主细胞库和工作细胞库的靶基因遗传稳定性需通过全长cDNA序列测序进行鉴别;各库的靶基因拷贝数和插入位点也将检测;各库的其他检测(如细菌、真菌、病毒等检测)将送到专业机构外检。

二、主要仪器设备

1.细胞培养摇床(INFORS);

  用于悬浮细胞的培养和评估;

2.CLONEPIX2(Molecular Device)

  用于接种半固体的高产细胞挑选;

3.MicroPulser电穿孔仪(Bio-Rad)

  用于细胞转染;

4.CellReporter(Molecular Device)

  用于单细胞评估和记录。

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